手性色譜柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光學(xué)活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。

界說(shuō)：

通過(guò)引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間出現(xiàn)物理特征的差異，然后抵達(dá)光學(xué)異構(gòu)體拆分的目的。要完成手性辨認(rèn)，手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種互相效果。這種互相效果包括氫鍵、偶極-偶極效果、π-π效果、靜電效果、疏水效果或空間效果。手性分別效果是多種互相效果一同效果的效果。這些互相效果通過(guò)影響包埋復(fù)合物的構(gòu)成，特別位點(diǎn)與分析物的鍵合等而改動(dòng)手性分別效果。由于這種效果力較微弱，因此需求細(xì)心調(diào)理、優(yōu)化活動(dòng)相和溫度以抵達(dá)*佳分別效果。

分類及運(yùn)用：

迄今為止，尚沒(méi)有一種相似十八烷基鍵合硅膠（ODS）柱的廣泛適用的手性柱。不同化學(xué)性質(zhì)的異構(gòu)體不得不選用不同類型的手性柱，而市售的手性色譜柱一般價(jià)格昂貴，因此怎么根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)選擇適用的手性色譜柱對(duì)錯(cuò)常重要的。

分類體系：

根據(jù)手性固定相和溶劑的互相效果機(jī)制，Irving Wainer初度提出了手性色譜柱的分類體系：

第1類：通過(guò)氫鍵、π-π效果、偶極-偶極效果構(gòu)成復(fù)合物。

第2類：既有類型1中的互相效果，又存在包埋復(fù)合物。此類手性色譜柱中典型的是由纖維素及其衍生物制成的手性色譜柱。

第3類：根據(jù)溶劑進(jìn)入手性空穴構(gòu)成包埋復(fù)合物。這類手性色譜柱中*典型的是由Armstrong教授開(kāi)發(fā)的環(huán)糊精型手性柱[2]，其他冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）構(gòu)成的手性色譜柱也歸于此類。

第4類：根據(jù)構(gòu)成非對(duì)映體的金屬絡(luò)合物，是由Davankov開(kāi)發(fā)的手性分別技術(shù)，也稱為手性配位溝通色譜（CLEC）。

第5類：蛋白質(zhì)型手性色譜柱。手性分別是根據(jù)疏水互相效果和極性互相效果完成。

可是，隨著由于市場(chǎng)上可選擇的手性色譜柱越來(lái)越多，此分類體系有時(shí)很難將一些手性柱概括進(jìn)去。因此參看Irving Wainer的分類方法，根據(jù)固定相的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將手性色譜柱分為以下幾種：

刷（Brush）型或稱為Prikle型

纖維素（Cellulose）型

環(huán)糊精（Cyclodextrin）型

大環(huán)抗生素（Macrocyclicantibiotics）型

蛋白質(zhì)（Protein）型

配位溝通（|Ligandexchange）型

冠醚（Crown ethers）型

1、刷型：

刷型手性色譜柱的出現(xiàn)和展開(kāi)源于Bill Prikle及其搭檔的卓越作業(yè)。六十年代，Bill Prikle將手性核磁共振中的效果運(yùn)用到手性HPLC固定相研討中，通過(guò)不斷實(shí)踐，發(fā)清楚運(yùn)用規(guī)劃較廣、柱效很好的手性色譜柱。刷型手性色譜柱是根據(jù)三點(diǎn)辨認(rèn)方式規(guī)劃的，歸于Irving Wainer分類中的*種類型。

刷型手性固定相分為π電子接受型和π電子供應(yīng)型兩類。*常見(jiàn)的π電子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸鍵合到γ-氨丙基硅膠上的制成。此類刷型手性色譜柱可以分別許多可供應(yīng)π電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對(duì)化合物進(jìn)行衍生化后進(jìn)行手性分別。

π電子供應(yīng)型固定相常見(jiàn)的是共價(jià)結(jié)合到硅膠上的萘基氨基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有π電子接受基團(tuán)，例如二硝基苯甲酰基。醇類、羧酸類、胺類等，可以用氯化二硝基苯甲酰、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進(jìn)行衍生化后，用π電子供應(yīng)型固定相抵達(dá)手性分別。

刷型固定相的優(yōu)勢(shì)在于其易于組成。組成方法在Bill Prikle的著作中有詳細(xì)的闡明。其他，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的晦氣之處在于它僅對(duì)芳香族化合物有用，有時(shí)不得不進(jìn)行衍生化反響。但值得一提的是，這種衍生化反響對(duì)錯(cuò)手性衍生反響，所以不存在手性衍生的問(wèn)題。刷型手性色譜運(yùn)用的活動(dòng)相基本是極性弱的有機(jī)溶劑，這關(guān)于制備色譜來(lái)講未必是缺點(diǎn)。

近來(lái)，刷型固定相出現(xiàn)了π電子供應(yīng)和接受基因的混合固定相。如：WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分適用于β-阻斷劑的手性分別。典型的活動(dòng)相為二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例為85：10：5。參加10mM醋酸銨可以調(diào)整保存時(shí)刻。SS BLAMO Ⅱ，一同具有π電子供體區(qū)和受體區(qū)，構(gòu)成手性裂縫，因此關(guān)于某些分子具有很高選擇性。

2、纖維素型：

纖維素型手性色譜柱的分別效果包括互相招引的效果及構(gòu)成包埋復(fù)合物。它們歸于Wainer分類中的第2種類型。市售的手性色譜柱為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸鹽纖維素固定相。許多化合物可通過(guò)此類型的色譜柱得到分別。這種類型的手性色譜柱種類也很齊全。活動(dòng)相運(yùn)用低極性溶劑，典型的活動(dòng)相為異丙醇-正己烷混合物。這類柱子根據(jù)制作工藝，分為涂敷與鍵合兩大類。但特別要注意由于氯可以使涂敷纖維素從硅膠上墜落，因此要保證涂敷類柱子活動(dòng)相中無(wú)含氯溶劑。

3、環(huán)糊精型：

環(huán)糊精是通過(guò)BacillusMacerans 淀粉酶或環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶水解淀粉得到的環(huán)型低聚糖。通過(guò)操控環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的水解反響條件可得到不同尺度的環(huán)糊精。市售的環(huán)糊精首要是α、β、γ三種類型，分別含6、7、8個(gè)吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精分子成錐筒型，構(gòu)成一個(gè)窟窿，窟窿的孔徑由構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的數(shù)目抉擇。環(huán)糊精類型及窟窿的孔徑等見(jiàn)下表：

環(huán)糊精 糖元數(shù)目 窟窿孔徑 可進(jìn)入窟窿的分子類型，手性中心數(shù)目

α 6 4.5-6.0 5-6元環(huán)的芳香族化合物，30

β 7 6.0-8.0 聯(lián)苯或萘， 35

γ 8 8.0-10.0 代替芘和類固醇， 40

2，3位仲羥基分布在環(huán)糊精洞口，6位伯羥基在環(huán)糊精分子的外部，這意味著窟窿內(nèi)部是相對(duì)疏水的區(qū)域。用環(huán)糊精手性固定相產(chǎn)生手性辨認(rèn)要求被拆分物的疏水部分能嵌入環(huán)糊精窟窿中，構(gòu)成可逆的、安穩(wěn)性不同的包合物，環(huán)糊精洞口的羥基和被拆分物的極性基團(tuán)互相效果。

由于構(gòu)成包合物速度較慢，因此或許導(dǎo)致色譜峰峰形較差，相同也影響了其在制備色譜中的運(yùn)用。環(huán)糊精固定相的選擇性取決分析物的分子巨細(xì)；α-環(huán)糊精只能容許單苯基或萘基進(jìn)入，β-環(huán)糊精容許萘基及多代替的苯基進(jìn)入，γ-環(huán)糊精僅用于大分子萜類。β-環(huán)糊精手性固定相運(yùn)用規(guī)劃*廣。Ibuprofen通過(guò)β-環(huán)糊精色譜柱得到分別，闡清楚pH值對(duì)氫鍵的影響。當(dāng)活動(dòng)相的pH=7時(shí)，觀察不到拆分的痕跡。pH=4時(shí)，可抵達(dá)好的分別效果。一般分別氨基酸時(shí)，常選用低的pH值，以按捺酸性基團(tuán)的離子化，一同也增強(qiáng)氨基的質(zhì)子化。磷酸三乙胺鹽、乙酸三乙胺鹽證明對(duì)β-環(huán)糊精色譜柱來(lái)說(shuō)是很好的緩沖液。一般緩沖液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸調(diào)理到適宜的pH值。高的流速會(huì)下降構(gòu)成復(fù)合物的才能，低流速分別效果較好，0.5-1ml/min的流速*好。其他，增加緩沖液的濃度可以克服流速的影響，由于它可以增加環(huán)糊精窟窿和活動(dòng)相的招引力。

常用緩沖液及其運(yùn)用濃度如下表所示：

緩沖液 濃度 目的

TEAA（乙酸三乙胺鹽） 0.01-2%

NH4NO3 10-500mM (用于減小包埋)

檸檬酸鹽 10-200mM (特別適合于酸性化合物)

醋酸銨 10-200mM

pH值選擇見(jiàn)下表:

緩沖液 pH值 目的

醇和胺 pH4 (加強(qiáng)NH的離子化)

酸 pH7

優(yōu)化手性分別條件要考慮的方面有：pH值對(duì)分別度的影響；流速對(duì)分別度的影響；柱溫、有機(jī)相比例、緩沖鹽濃度對(duì)分別度的影響。

環(huán)糊精的修飾：*近，對(duì)環(huán)糊精的修飾使環(huán)糊精型手性色譜柱可以分別更多的化合物，并可用于氣相手性色譜分別。衍生化是通過(guò)將不同的基因鍵合到環(huán)糊精窟窿表面的羥基上。衍生化反響包括乙基化、S-羥基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸鹽、3，5二甲基苯基氨基甲酸鹽和環(huán)狀對(duì)甲苯酰酯。這些新式的環(huán)糊精固定相有許多長(zhǎng)處，它們可以分別更多化合物，價(jià)格上也有競(jìng)爭(zhēng)力，由于改進(jìn)了手性辨認(rèn)才能使其更適用于制備色譜。

4、配位溝通型：

手性配位溝通色譜（Chiral LigandExchange Chromatography，CLEC）由

Davankov發(fā)明，是通過(guò)構(gòu)成光學(xué)活性的金屬絡(luò)合物而抵達(dá)手性分別，歸于Irving Wainer分類中的第4類手性固定相，首要用于分別氨基酸類。

由于此類固定相是由手性氨基酸—銅離子絡(luò)合物鍵合到硅膠或聚合物上形

成，因此活動(dòng)相中有必要含有銅離子以保證手性固定相上的銅離子不至流失。其它的過(guò)渡金屬元素也已用于手性配位溝通色譜，但銅離子運(yùn)用*廣。構(gòu)成絡(luò)合物的過(guò)程十分緩慢，因此有時(shí)需提高柱溫，*佳溫度約50℃。

手性配位溝通色譜僅對(duì)α- 氨基酸和其相似物有用。β- 氨基酸很難用手性

配位溝通色譜得以分別。手性配位溝通色譜可用于制備，由于活動(dòng)相中存在銅離子，盡管銅離子能用離子溝通柱除掉，但增加了樣品處理的困難。

5、大環(huán)抗生素型：

大環(huán)抗生素型手性色譜柱是*近展開(kāi)起來(lái)的，通過(guò)將大環(huán)抗生素鍵合到膠

上制成的新式手性色譜柱。大環(huán)抗生素型手性色譜柱的出現(xiàn)歸功于Dan Armstron 的奉獻(xiàn)。此類色譜柱常用的大環(huán)抗生素首要由三種：利福霉素（Rifamycin），萬(wàn)古霉素（Vancomycin），替考拉寧（Ticoplanin）。利福霉素作為手性增加劑在毛細(xì)管電泳分別手性化合物方面得到了成功運(yùn)用。萬(wàn)古霉素和替考拉寧分子結(jié)構(gòu)中存在“杯”狀結(jié)構(gòu)區(qū)和糖“平面” 結(jié)構(gòu)區(qū)。此類色譜柱性質(zhì)安穩(wěn)，可用于多種分別方式。手性分別根據(jù)氫鍵、π-π效果、構(gòu)成包合物、離子效果和肽鍵等。

替考拉寧分子量為1885，結(jié)構(gòu)中存在20個(gè)手性中心，3個(gè)糖基和4個(gè)環(huán)。酸性基團(tuán)在多肽“杯”/ “裂層”的一端，堿性基團(tuán)在它的另一端。酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)供應(yīng)了離子效果點(diǎn)。糖基在三個(gè)平面上，可折疊起來(lái)將化合物分子包埋在多肽“杯”中。

萬(wàn)古霉素分子量為1449，結(jié)構(gòu)中存在18個(gè)手性中心，3個(gè)環(huán)。萬(wàn)古霉素具有“籃狀”結(jié)構(gòu)，它的鄰近還有一個(gè)可曲折的糖平面，可將分析物分子包埋在“籃子”中。羧基和仲氨基分布在“籃子”的邊際，參加和分析物分子產(chǎn)生離子效果。萬(wàn)古霉素手性色譜柱可用于反相方式、正相方式和極性方式。萬(wàn)古霉素手性色譜柱可以分別胺類、中性酰胺、脂類。但關(guān)于酸性化合物選擇性較低。在反相方式中，有機(jī)相常用四氫呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸緩沖液。色譜柱適用的pH規(guī)劃為4-7。一般優(yōu)化堿性化合物手性分別條件時(shí)，選擇pH=7 為起點(diǎn)比較好。其他四氫呋喃、乙腈有*好的選擇性。有時(shí)選用純的甲醇和乙醇作活動(dòng)相也可抵達(dá)好的分別效果。萬(wàn)古霉素手性色譜柱也可用正相方式，選用正己烷/乙醇為活動(dòng)相。

萬(wàn)古霉素手性色譜柱載樣量可以很大，十分適用于制備色譜。

6、蛋白質(zhì)型：

蛋白質(zhì)型手性色譜柱歸于第5種類型。分別依賴于疏水互相效果和極性互相效果。已經(jīng)有多種蛋白質(zhì)用于此類手性色譜柱。運(yùn)用較多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵類粘蛋白（Ovomucoid，OV）。

α-酸性糖蛋白分子由181個(gè)氨基酸殘基和40個(gè)唾液酸（sialic acid）殘基構(gòu)成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等電點(diǎn)為2.7。含有兩個(gè)二硫鍵，性質(zhì)很安穩(wěn)。α-酸性糖蛋白分子可以共價(jià)鍵合到硅膠上，制成手性色譜柱，可以分別許多化合物。

α-酸性糖蛋白手性色譜柱運(yùn)用的活動(dòng)相一般為pH 4-7的磷酸鹽緩沖液和很小比例的有機(jī)相。有機(jī)相首選異丙醇，如達(dá)不到分別要求，可以嘗試乙腈，乙醇，甲醇或四氫呋喃。有機(jī)相的改動(dòng)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生暫時(shí)的改動(dòng)。色譜柱的負(fù)載量至關(guān)重要，典型的負(fù)載量為0.02mg/ml的濃度樣品，進(jìn)樣20μl。pH 的改動(dòng)對(duì)手性選擇性起關(guān)鍵效果，尤其是胺類化合物。pH下降導(dǎo)致蛋白質(zhì)負(fù)電荷的下降，引起胺類化合物保存時(shí)刻減小，然而這意味著可以減小有機(jī)相比例，使選擇性增加，峰形改進(jìn)。

通過(guò)調(diào)理有機(jī)相比例仍無(wú)法抵達(dá)分別效果時(shí)，有時(shí)需用電荷調(diào)理劑。但這或許引起蛋白結(jié)構(gòu)的永久改動(dòng)，這些電荷調(diào)理劑包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有時(shí)也用到1，2 亞乙基二醇，1，2丁醇和氯化鈉。溫度對(duì)分別也有影響，溫度增加保存時(shí)刻，減小分別因子。

人血清白蛋白（HSA）分子量為69,000，等電點(diǎn)為4.8。蛋白中認(rèn)為存在兩個(gè)藥物結(jié)合位點(diǎn)：華法則-氮雜普魯帕宗（warfarin-azapropazone）和苯基二氮雜-吲哚（benzodiazapine-indole）結(jié)合位點(diǎn)。活動(dòng)相中參加辛酸，選用人血清白蛋白手性色譜柱可以有用分別benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色譜柱得到了分別，活動(dòng)相組成為：100mM磷酸緩沖液pH7：乙腈：異丙醇 = 84：10：6。

牛血清白蛋白（BSA）為球型蛋白，分子量為66,000，等電點(diǎn)為4.7。此蛋白為一個(gè)單氨基酸鏈，通過(guò)17個(gè)二硫鍵構(gòu)成9個(gè)雙環(huán)。許多化合物通過(guò)牛血清白蛋白手性色譜柱得到分別。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白安穩(wěn)，一些有機(jī)溶劑（如乙腈、甲醇）可使蛋白變性，因此運(yùn)用起來(lái)要特別注意。

卵類粘蛋白由蛋清中提取，分子量為55,000。它可分別很多的胺類和酸類化合物。

蛋白手性色譜柱的載樣量均較小。影響了蛋白手性色譜柱在制備色譜中的運(yùn)用。

蛋白手性色譜柱在所有手性色譜柱中是運(yùn)用*廣的色譜柱，但并不是效果*好的色譜柱。

7、冠醚型：

冠醚類固定相用于分別一級(jí)胺，一級(jí)胺有必要質(zhì)子化方能抵達(dá)分別。因此有必要

運(yùn)用酸性活動(dòng)相，如高氯酸。*常用的是冠醚類固定相是18-冠-6，已有商品化

產(chǎn)品，由Daicel公司制作。不管（+）或（-）型均可抵達(dá)有用分別，并可通過(guò)改動(dòng)（+）（-）類型而改動(dòng)分析物出峰順序。冠醚作為增加劑也用于核磁共振和電泳，但由于其毒性較大，有致癌性，使其運(yùn)用受到限制。